Αυτή η πρώτη περίπτωση γενετικού χειρισμού σε μια σαύρα δημιούργησε ένα πρότυπο οργανισμό που θα μπορούσε να βοηθήσει στην περαιτέρω κατανόηση της εξέλιξης και ανάπτυξης των ερπετών
CRISPR-Cas9 ή απλά CRISPR είναι ένα μοναδικό, γρήγορο και φθηνό γονίδιο εργαλείο επεξεργασίας που επιτρέπει την επεξεργασία ενός γονιδιώματος με διαγραφή, προσθήκη ή τροποποίηση DNA. Το ακρωνύμιο CRISPR σημαίνει «Συγκεντρωμένες τακτικές επαναλήψεις μεταξύ παλίνδρομων». Αυτό το εργαλείο είναι απλό και πιο ακριβές από τις προηγούμενες μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν για επεξεργασία DNA.
Το εργαλείο CRISPR-Cas9 εγχέει οργανισμούς στο στάδιο του ζυγώτη (μονοκύτταρο) με ένα κατασκεύασμα DNA που αποτελείται από (α) ένζυμο Cas9 το οποίο λειτουργεί ως «ψαλίδι» και μπορεί να κόψει ή να διαγράψει ένα μέρος του DNA, (β) καθοδηγητικό RNA - μια αλληλουχία που ταιριάζει με το γονίδιο στόχο και έτσι οδηγεί το ένζυμο Cas9 στη θέση στόχο. Μόλις κοπεί ένα τμήμα στόχου του DNA, ο μηχανισμός επιδιόρθωσης του DNA του κυττάρου θα επανενώσει τον υπόλοιπο κλώνο και, στη διαδικασία, θα σιωπήσει το στοχευόμενο γονίδιο. Ή το γονίδιο θα μπορούσε να «διορθωθεί» χρησιμοποιώντας ένα νέο τροποποιημένο πρότυπο DNA σε μια διαδικασία που ονομάζεται επιδιόρθωση κατευθυνόμενη από ομολογία. Έτσι, το εργαλείο CRISPR-Cas9 επιτρέπει γενετικές τροποποιήσεις με ένεση γονιδιακή επεξεργασία διαλύματα σε μονοκύτταρο γονιμοποιημένο ωάριο. Αυτή η διαδικασία προκαλεί μια γενετική αλλοίωση (μετάλλαξη) σε όλα τα επόμενα κύτταρα που παράγονται επηρεάζοντας έτσι τη λειτουργία των γονιδίων.
Αν και το CRISPR-Cas9 χρησιμοποιείται τακτικά σε πολλά είδη, συμπεριλαμβανομένων των ψαριών, των πτηνών και των θηλαστικών, μέχρι στιγμής δεν έχει καταφέρει να χειραγωγήσει γενετικά ερπετά. Αυτό οφείλεται κυρίως σε δύο εμπόδια. Πρώτον, τα θηλυκά ερπετά αποθηκεύουν το σπέρμα για μεγάλο χρονικό διάστημα στον ωαγωγό τους, καθιστώντας δύσκολο τον ακριβή προσδιορισμό του χρόνου γονιμοποίησης. Δεύτερον, η φυσιολογία των αυγών των ερπετών έχει πολλά χαρακτηριστικά όπως εύκαμπτα κελύφη αυγών, ευθραυστότητα χωρίς χώρο αέρα στο εσωτερικό, καθιστώντας δύσκολο τον χειρισμό των εμβρύων χωρίς να προκαλείται ρήξη ή ζημιά.
Σε άρθρο που ανέβηκε στο bioRxiv on March 31, 2019 researchers have reported development and testing of a way to use CRISPR-Cas9 επεξεργασία γονιδίων in reptiles for the first time. The reptile species chosen in the study was a tropical σαύρα που ονομάζεται Ανώλης σαγρέη ή συνηθέστερα καφέ ανόλη που είναι ευρέως διαδεδομένη στην Καραϊβική. Οι σαύρες της μελέτης συλλέχθηκαν από μια άγρια περιοχή στη Φλόριντα των ΗΠΑ. Αυτό το είδος είναι ιδανικό για τη μελέτη λόγω του μικροσκοπικού του μεγέθους, της μεγάλης περιόδου αναπαραγωγής και του σχετικά μικρού μέσου χρόνου μεταξύ δύο γενεών.
Για να ξεπεράσουν τους περιορισμούς που αντιμετωπίζουν επί του παρόντος τα ερπετά, οι ερευνητές έκαναν μικροέγχυση συστατικών CRISPR σε ανώριμα μη γονιμοποιημένα ωάρια ενώ τα αυγά βρίσκονταν ακόμη στις ωοθήκες των θηλυκών σαύρων πριν από τη γονιμοποίηση. Στοχεύτηκαν στο γονίδιο της τυροσινάσης το οποίο παράγει ένα ένζυμο που ελέγχει τη μελάγχρωση του δέρματος στις σαύρες και εάν αφαιρεθεί αυτό το γονίδιο, η σαύρα θα γεννιόταν αλμπίνο. Αυτός ο σαφής φαινότυπος μελάγχρωσης ήταν ο λόγος για την επιλογή του γονιδίου της τυροσινάσης. Τα ωάρια που υποβάλλονται σε μικροέγχυση στη συνέχεια ωριμάζουν μέσα στο θηλυκό και στη συνέχεια γονιμοποιούνται φυσικά με εισαγόμενο αρσενικό ή αποθηκευμένο σπέρμα.
As a result, four albino lizards were born few weeks later confirming that gene tyrosinase was deactivated and the επεξεργασία γονιδίων process was successful. Since the offspring contained edited gene from both parents it was clear that CRISPR components remained active much longer in mother’s immature oocyte and post fertilization it mutated paternal genes. Thus, mutant albino lizards exhibited manipulated tyrosinase in genes inherited from both mother and father as albinism is a trait inherited from both parents.
Αυτή είναι η πρώτη μελέτη που παράγει αποτελεσματικά γενετικά τροποποιημένα ερπετά. Η έρευνα θα μπορούσε να λειτουργήσει με παρόμοιο τρόπο σε άλλα είδη σαύρας όπως τα φίδια για τα οποία οι τρέχουσες προσεγγίσεις ήταν ανεπιτυχείς μέχρι στιγμής. Αυτή η εργασία θα μπορούσε να βοηθήσει στην περαιτέρω κατανόηση της εξέλιξης και ανάπτυξης των ερπετών.
***
{Αυτή η μελέτη έχει υποβληθεί προς το παρόν για αξιολόγηση από ομοτίμους. Μπορείτε να διαβάσετε την προεκτυπωμένη έκδοση κάνοντας κλικ στον σύνδεσμο DOI που δίνεται παρακάτω στη λίστα των αναφερόμενων πηγών}
Πηγές)
Rasys AM et al. 2019. Preprint. CRISPR-Cas9 Επεξεργασία γονιδίων in Lizards Through Microinjection of Unfertilized Oocytes. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/591446
